Untersuchungen zum Endocannabinoidsystem und zur endocannabinoidvermittelten Kontrolle der Energiehomöostase bei spätlaktierenden Milchkühen Das Endocannabinoid-System (ECS) ist ein umfassendes und vielschichtiges System im Körper aller Wirbeltiere. Es besteht aus G-Protein-gekoppelten Cannabinoidrezeptoren, ihren endogenen Liganden – den sogenannten Endocannabinoiden – und den entsprechenden synthetisierenden und abbauenden Enzymen. In den letzten Jahren hat intensive Forschung wertvolle Einblicke in die Schlüsselelemente des ECS und seine weitreichende Beteiligung an vielen Regulationsprozessen bei Nicht-Wiederkäuern, vor allem bei Nagetieren und Menschen, ermöglicht. Im Hinblick auf die Energiehomöostase mit der Steuerung der Futteraufnahme und des Appetits sowie der Stressreaktion und des Lipid- und Glukosestoffwechsels wurden viele Mechanismen der Endocannabinoidwirkung identifiziert. Dennoch blieben viele Fragen unbeantwortet, insbesondere in Bezug auf Wiederkäuer. Bei Milchkühen könnte die gezielte Aktivierung des ECS ein vielversprechender therapeutischer Ansatz zur Bewältigung von Problemen in der Transitphase darstellen, jedoch ist das derzeitige Verständnis über das ECS bei Wiederkäuern nicht ausreichend. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Grundlagen des ECS bei Milchkühen weiter zu charakterisieren und seine Beteiligung an den Steuerungsprozessen der Energiehomöostase durch Verabreichung der beiden Endocannabinoide N-Arachidonylethanolamid (Anandamid, AEA) und 2-Arachidonylglycerol (2-AG) zu untersuchen. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden eine Reihe von Versuchen mit nicht trächtigen, spätlaktierenden Simmentaler Kühen durchgeführt. Im Rahmen dieser Dissertation wurden eine Reihe von Experimenten durchgeführt, um ein besseres Verständnis der Dynamik des zirkulatorischen Endocannabinoid-Tonus bei Milchkühen zu erlangen. Milchkühe wurden (i) kurzzeitigem Futterentzug, (ii) Stressbelastung, (iii) verschiedenen Rationszusammensetzungen (niedriges und hohes n6/n3-Fettsäureverhältnis) und (iv) i.p.-Injektionen von AEA und 2-AG ausgesetzt, mit anschließender Analyse der Plasma-Endocannabinoid-Konzentrationen. Die Analysen ergaben, dass sowohl Futterentzug als auch Stressbelastung die 2-AG-Konzentration im Plasma von Milchkühen in unterschiedlichem Maße erhöhten, ähnlich wie bei Nicht-Wiederkäuern, während die AEA-Konzentration im Plasma unverändert blieb. Es scheint, dass 2-AG bei Milchkühen stärker an der systemischen Stoffwechselreaktion auf Futterentzug und Stressbelastung beteiligt ist als AEA. Anders als bei Nicht-Wiederkäuern führte die Fütterung einer n6/n3-reichen Ration bei Milchkühen nicht zu einer Erhöhung der Endocannabinoid-Konzentrationen im Plasma. Die systemische Verabreichung von AEA erhöhte 2,5 Stunden nach der Injektion die AEA-Konzentrationen im Blutkreislauf, während die Verabreichung von 2-AG die Endocannabinoid-Konzentrationen im Plasma 2,5 Stunden nach der Injektion nicht veränderte. Die Unterschiede in der Bioverfügbarkeit von injiziertem AEA und 2-AG und die mögliche Akkumulation von AEA erfordern in Zukunft genauere Untersuchungen. Um die Auswirkungen von i.p. verabreichten Endocannabinoiden auf die Futteraufnahme und die hypothalamische orexigene Signalgebung bei Milchkühen zu untersuchen, wurde die Futteraufnahme kontinuierlich elektronisch erfasst und in verschiedenen Intervallen analysiert. Die Analysen ergaben, dass i.p. verabreichtes AEA und 2-AG in einer Dosierung von 5 μg/kg bzw. 2,5 μg/kg hauptsächlich die Futteraufnahme kurzfristig innerhalb der ersten Stunde nach der Behandlung beeinflusste und keine Langzeitwirkung hatte. Am Ende des Versuchs wurden die Kühe 2 bis 3 Stunden nach der i.p. Endocannabinoid-Injektion geschlachtet, und es wurde Hirngewebe für die immunhistochemische Analyse von Agouti-related Peptid (AgRP), Orexin A (OX-A) und Cannabinoid-Rezeptor (CB1) exprimierenden Neuronen sowie für die PCR-Analyse von AgRP, Neuropeptid Y (NPY) und Genen, die mit dem ECS in Verbindung stehen, entnommen. Aus immunhistochemischen Untersuchungen hypothalamischer Orexigene ergaben sich allerdings keine Hinweise auf eine endocannabinoidvermittelte Neuromodulation oder c-Fos-Aktivierung. Die Genexpression von ECS-assoziierten Genen im Nucleus arcuatus (ARC) und Nucleus paraventricularis (PVN) von Milchkühen auf mRNA-Ebene unterschied sich ebenfalls nicht zwischen den Behandlungsgruppen. Allerdings wurden die mRNA-Abundanzen von NPY und AgRP im ARC von AEA-behandelten Tieren herunterreguliert, was auf einen möglichen gegenregulatorischen Mechanismus hinweisen könnte. Um zu testen, ob Kühe möglicherweise von der Verabreichung von Endocannabinoiden bei Stress im Hinblick auf stressbedingte Veränderungen der Futteraufnahme profitieren, wurde die Futteraufnahme mit und ohne Stressreize wie soziale und taktile Isolation und Anbindehaltung verglichen. Es wurde herausgefunden, dass die Verabreichung von AEA und 2-AG die stressinduzierte Hypophagie abschwächt. Um den Einfluss der verabreichten Endocannabinoide auf den Gesamtstoffwechsel besser zu verstehen, wurden die Kühe zweimal drei Tage lang in Respirationskammern gehalten, um den Gasaustausch kontinuierlich aufzuzeichnen. Es zeigte sich, dass die Behandlung mit AEA und 2-AG zu einem Anstieg der Kohlenhydratoxidation (COX) und der metabolen Wärmeproduktion (HP) sowie zu einem Rückgang der Fettoxidation (FOX) führte, was die oben erwähnten endocannabinoidvermittelten Veränderungen der Futteraufnahme widerspiegelt. Eine von der Futteraufnahme unabhängige Analyse zeigte, dass sich die COX-Werte zwischen den Behandlungsgruppen nicht unterschieden, während die FOX-Werte unter der Endocannabinoid-Behandlung niedriger blieben, was darauf hindeutet, dass die Endocannabinoidwirkung über die Effekte auf Futteraufnahme hinausgeht, und dass AEA und 2-AG den Fettabbau unterdrücken und die Lipogenese fördern. Um ein erstes Verständnis der Auswirkungen der verabreichten Endocannabinoide auf den Fettstoffwechsel zu gewinnen, wurden vor und nach 9 Tagen täglicher Behandlung Plasmaproben entnommen und auf die Konzentration freier Fettsäuren im Plasma sowie auf weitere Plasmalipidkonzentrationen untersucht. Wir konnten zeigen, dass die injizierten Endocannabinoide den mit der stressinduzierten Hypophagie verbundenen Anstieg der Konzentration freier Fettsäuren im Plasma abschwächten. Ferner deuten die Analysen darauf hin, dass möglicherweise mit Endocannabinoid-Applikation freie Fettsäuren in erhöhtem Maße zur Triglyceridsynthese in Adipozyten verwendet werden. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die hier diskutierten Ergebnisse neue und wichtige Erkenntnisse über das ECS bei Milchkühen liefern. Dieses Forschungsgebiet befindet sich noch in der Anfangsphase, und es sind weitere Studien zum ECS bei der Milchkuh notwendig, um das therapeutische Potential von Endocannabinoiden weiter zu heben. Die vorgestellten Ergebnisse und die veröffentlichten Studien dienen jedoch als Grundlage für künftige Forschungen.weiterlesen