Zusammenfassung Ausgangspunkt dieser Arbeit war die Suche nach Proteinen, die bevorzugt an phosphorylierte Granula binden und an stärke-relevanten Prozessen beteiligt sind, die der Phosphorylierung durch die Glukan-Wasser-Dikinase (GWD) nachgeschaltet sind. Dazu wurde ein Test etabliert, in dem die Bindung von Proteinen aus Blattextrakten von Arabidopsis thaliana an phosphorylierte und nichtphosphorylierte Stärkegranula verglichen wurde. In diesen Tests wurde ein bisher unbekanntes Protein mit geringer Homologie zur GWD identifiziert, das präferentiell an phosphorylierte Stärke bindet. Die Funktion dieses Proteins wurde sowohl in vitro als auch in vivo charakterisiert. Die in vitro-Charakterisierung des heterolog in E. coli exprimierten Proteins zeigte, dass es die neuartige enzymatische Aktivität einer Phosphoglukan-Wasser-Dikinase (PWD) aufweist. PWD ist in der Lage Stärke in vitro zu phosphorylieren, jedoch nur, wenn die Stärke bereits kovalent gebundenes Phosphat enthält. Demnach ist PWD „downstream“ von GWD aktiv. Der Reaktionsmodus beinhaltet den Transfer des E-P von ATP zunächst auf einen Histidinrest von PWD und von dort auf ein Phosphoglukan. Das J-P von ATP wird auf Wasser übertragen. Die Analyse des in vitro phosphorylierten Stärkesubstrates ergab, dass PWD vorwiegend oder ausschließlich die C-3-Position von Glukosyleinheiten in Stärke phosphoryliert. Im Gegensatz dazu überträgt GWD Phosphat etwa im Verhältnis 2:1 auf die C-6- bzw. C-3-Position. Die mit dem heterolog exprimierten PWD-Protein erzielten Ergebnisse wurden bestätigt durch Experimente mit PWD-Protein, das aus Arabidopsis thaliana sex1-3-Mutanten isoliert wurde. Die subzelluläre Lokalisierung von PWD in Chloroplasten konnte mit Hilfe eines in Kaninchen hergestellten polyklonalen anti-PWD-Antikörpers durch Immunoblot-Analyse von Extrakten aus isolierten Proto- und Chloroplasten gezeigt werden. Bestätigt wurde die plastidäre Lokalisierung durch nicht-wässrige Fraktionierung von Blattextrakten. Die physiologische Funktion von PWD wurde in transgenen Arabidopsis-Pflanzen untersucht, in denen die Expression von PWD entweder durch eine T-DNA-Insertion (pwd) oder durch RNA-Interferenz (RNAi) verringert war. Sowohl die pwd- als auch die RNAi-Pflanzen hatten zu allen untersuchten Zeitpunkten deutlich erhöhte Blattstärkegehalte gegenüber dem Wildtyp. Hinsichtlich des Verhältnisses von Glc-6-P:Glc-3-P wiesen die Stärken von transgenen und Wildtyp- Pflanzen geringe Unterschiede auf. Das in der Stärke der transgenen Pflanzen leicht erhöhte Verhältnis war zurückzuführen auf einen erhöhten Glc-6-P-Gehalt bei unverändertem Glc-3-P-Gehalt. Der Anteil des Granula-assoziierten PWD nahm unter Bedingungen des Netto-Stärkeabbaus im Dunkeln deutlich zu. Es wird angenommen, dass PWD eine transiente Phosphorylierung der C-3-Position von Glukosyleinheiten an der Granula-Oberfläche während des Netto-Stärkeabbaus im Dunkeln katalysiert.weiterlesen