Frank Schleifenbaum Energy transfer in the red fluorescent protein DsRed in confined optical fields Energieüberträge in dem rot fluoreszierenden Protein DsRed in definiert begrenzten optischen Feldern Dissertation an der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Eberhard-Karls-Universität Tübingen Dekan: Prof. Dr. L. Wesemann 1. Berichterstatter: Prof. Dr. A. J. Meixner 2. Berichterstatter: Prof. Dr. G. Gauglitz 3. Berichterstatter: Prof. Dr. M. Sauer Band 2 der Schriftenreihe LIFE SCIENCES. 150 Seiten. Zahlreiche Abbildungen, 21 davon in Farbe. Broschur. Preis: 29,50 Euro. ISBN 978-3-938807-44-6. Rhombos-Verlag, Berlin 2008 Summary In this thesis, novel approaches to investigate and control fluorescence resonant energy transfer (FRET) by optical field confinement are presented. As a model system, the red fluorescent protein DsRed was studied. DsRed is known to form rigid tetramers consisting of diverse fluorescent subunits in a random composition. This makes it an appropriate system for FRET-studies, since the rigidity of the structure circumvents chromophoric diffusion whereas the random composition of the distinct tetramers elucidates the potential of the presented techniques for studying complex energy transfer systems. After an introduction into the topic and the experimental techniques is given in chapters 1 and 1, results of multiparameter spectroscopy of individual DsRed tetramers are presented in chapter 1. By combination of spectral and time resolved microscopy on the same single protein, for the first time it is possible to obtain a complete set of spectroscopic parameters to quantitatively describe the energy transfer process, purely based on experimental data. Here, the spectroscopic results reveal that the green emitting donor chromophore of DsRed exhibits an unexceptional long fluorescence lifetime when no acceptor chromophore is present. This knowledge provides new insights into the photophysics of DsRed since so far the green chromophore was believed to be a homologue to the chromophore of the green fluorescent protein GFP with a shorter fluorescence lifetime due to structural and chemical identity. In chapter 4, fluorescence and Raman imaging as well as spectroscopy of the same individual protein-molecule and its photobleaching products is reported. Due to the combination of two spectroscopic modes it is proven that surface enhanced resonance Raman scattering (SERRS) is possible on single emitting species, a question which arose a vivid scientific discussion over the last decade. On basis of fluorescence spectroscopy prior to Raman measurements it was possible to assign distinct Raman bands to fluorescent features of the investigated individual proteins. In this section, a novel approach for surface enhancement of the Raman signal is presented, using thin silver island-films as a SERS active system. Due to the homogeneous surface coating achieved by evaporating thin metal films on a surface, Raman-intensity profiles of the sample area can be recorded, opening the field of Raman imaging with high sensitivity and robustness to a broad variety of applications in life-sciences. Moreover, it is shown that no chemical enhancement is required to achieve single molecule Raman sensitivity, which is in good agreement with theoretical treatments, yielding that the electromagnetic enhancement of the Raman process is several orders of magnitude higher than the relatively weak chemical enhancement effect. Chapter 1 refers to the spectral control of Förster energy transfer of FRET-systems by varying the photonic mode of a sub-wavelength Fabry-Perot microresonator. As the non-radiative energy transfer is modified by the changed electromagnetic field, it is shown that the method enables the spectral isolation of chemically fixed FRET-pairs in the ensemble as well as on the single entity level. As the induced dipole moments of the embedded dyes are deformed by the introduced boundary conditions, the optical nearfield of the molecules is enhanced along the resonant longitudinal cavity mode, resulting in an increased critical Förster distance R0 for molecules embedded in the microresonator. It is shown that, even on the single entity level, the microresonator effectively controls the Förster energy transfer, thus allowing for the investigation of the unquenched donor emission in presence of an acceptor. In chapter 1 it is shown that the microresonator geometry presented in chapter 1 allows for the disentanglement of a dipole-coupled dye-pair by modifying the absorption probability of the embedded dyes. The effect of donor-dequenching is shown as an increase of the donor-to-acceptor intensity ratio for both cw- and pulsed excitation. Computational simulations are presented, supporting the experimental results. Moreover, the energy transfer efficiencies for various absorption probabilities are determined, revealing non-linear behavior for the Förster-process for externally confined electromagnetic fields. The photobleaching kinetics of the respective chromophores of the investigated DsRed FRET-system were studied, revealing dramatic changes for a variation of the mode density of the electromagnetic field. Furthermore, fluorescence lifetime measurements are reported, revealing that donor-dequenching can be controlled by tuning the time delay of two succeeding light-pulses. Chapter 1 refers to prospective applications using the presented microresonator design. A novel technique for direct determination of the fluorescence quantum yield in a native environment based on experimental investigations and computational modeling is presented. This new method is capable to outperform standard methods due to its independence of reference standards combined with a high cost-efficiency. Moreover, a modified microresonator geometry is introduced which allows for fluorescence studies in the liquid phase using exceptional small sample amounts. The impact of rotational diffusion on the microresonator controlled emission is discussed and shown by both experimental data and the results obtained from theoretical modeling. The ultra-low sample amounts required for microresonator studies combined with the ability to investigate liquid systems suggests the presented technique for applications as an analytical tool in integrated optical systems. Zusammenfassung In dieser Arbeit werden neuartige Verfahren zur Untersuchung und zur Steuerung von Fluoresezenz Resonanz Energieüberträgen (FRET) mit Hilfe des optischen Feldes vorgestellt. Als Modellsystem wurde das rot fluoreszierende Protein DsRed untersucht. DsRed ist für die Ausbildung von stabilen Tetrameren bekannt, welche aus unterschiedlichen grün und rot fluorezierenden Untereinheiten in statistischer Zusammensetzung aufgebaut sind. Durch die Stabilität der Struktur ist zum einen eine feste räumliche Orientierung der chromophoren Einheiten zueinander sichergestellt, zum anderen stellt die statistische Verteilung von grün und rot fluoreszierenden Untereinheiten eine Herausforderung an die präsentierten Methoden dar. Nach einer allgemeinen Einführung in das Themengebiet sowie der Vorstellung der verwendeten experimentellen Methoden in den Kapiteln 1 und 2, werden in Kapitel 3 Ergebnisse von multiparametrischer Spektroskopie an einzelnen DsRed-Tetrameren präsentiert. Durch die Kombination von spektral und zeitlich aufgelöster Mikroskopie gelingt zum ersten Mal die vollständige Zusammenstellung aller spektroskopischen Parameter zur quantitativen Beschreibung der Energietransferprozesse auf Basis rein experimenteller Daten. Die Befunde ergeben, dass der grün fluoreszierende Donor-Chromophor eine unerwartet lange Fluoreszenzlebensdauer aufweist, wenn kein Akzeptorchromophor als Fluoreszenzlöscher zugegen ist. Diese Erkenntnis gibt neuartige Einblicke in die Photophysik des DsRed, dessen grün fluoreszierender Chromophor bislang als Homologes des grün fluoresziereden Proteins GFP aufgrund der strukturellen und chemischen Gleichheit verstanden wurde. In Kapitel 4 werden Ergebnisse von bildgebenden und spektral aufgelösten Fluoreszenz- und Ramanmessungen an demselben einzelnen fluoresziereden Proteinmolekül und seinen Photoprodukten vorgestellt. Durch die Kombination zweier spektroskopischer Methoden wird ein klarer Beweis geliefert, dass oberflächenverstärkte Resonanz-Ramanspektroskopie (SERRS) an einzelnen Emittern möglich ist, eine Frage, die während der letzten Dekade im Fokus lebhafter wissenschaftlicher Diskussionen stand. Durch die zuvor durchgeführten Fluoreszenzmessungen war es möglich, unterschiedlche Ramanbanden den Fluoreszenzcharakteristika der untersuchten einzelnen Proteine zuzuordnen. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass keine chemische Verstärkung notwendig ist um Raman-Einzelmolekülsensitivität zu erhalten. Durch die Verwendung von Silberinselfilmen als Raman-aktives System steht ein Verfahren zur Verfügung, bei dem die Ramaninformation als hoch-sensitives und gleichzeitig robustes Signal für die bildgebende Mikroskopie verwendet werden kann. Kapitel 5 beschäftigt sich mit der spektralen Kontrolle des Förster Energieübertrags in FRET-Systemen durch Variation der photonischen Mode in einem Lamda/2-Mikroresonator. Da der nicht-strahlende Energieübertrag durch das geänderte elektromagnetische Feld modifiziert wird, ist es möglich die einzelnen Chromophore in einem chemisch fixierten FRET-System sowohl im Ensemble als auch auf Einzelmolekülebene spektral zu isolieren. Da die induzierten Dipolmomente der eingebetteten Farbstoffmoleküle durch die durch den Mikroresonator eingeführten Grenzbedingungen deformiert werden, ist ihr optisches Nahfeld entlang der longitudinalen Resonatormode verstärkt. Hierdurch wird eine deutliche Zunahme des kritischen Förster-Abstandes R0 der eingebetten FRET-Systeme erreicht. In Kapitel 6 wird gezeigt, dass die zuvor vorgestellte Mikroresonator-geometrie eine Entkopplung von Dipol-Dipol Wechselwirkungen in Farbstoffpaaren durch die Kontrolle der Absorptionswahrscheinlichkeit der eingebetteten Farbstoffe erlaubt. Die Unterbindung eines Energieübertrags von Donor- zu Akzeptorchromophor wird sowohl für kontinuierliche als auch für gepulste Anregung gezeigt. Darüber hinaus wurden die Energiebübertragseffizienzen für unterschiedliche Absorptions-wahrscheinlichkeiten bestimmt und ein nicht-lineares Verhalten des Förster-Pozesses in extern eingegrenzten optischen Feldern konnte sowohl experimentell als auch durch Computersimulationen gezeigt werden. Es wurde demonstriert, dass der Energieübertrag durch Einstellen einer definierten Verzögerungszeit zwischen zwei aufeinanderfolgenden Anregungspulszügen kontrolliert werden kann. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Kinetik des Photobleichens der unterschiedlichen Chromophore eines FRET-Systems in einem Mikroresoantor deutlichen Änderungen für die jeweiligen Chromophore im Vergleich zum freien Raum mit elektromagnetischem Modenkontinuum unterliegen. In Kapitel 7 werden mögliche Anwedungen des vorgestellten Mikroresonators diskutiert. Hierbei wird eine neuartige Methode zur direkten Bestimmung der Fluoreszenzquantenausbeute in nativer Umgebung vorgestellt. Das neue Verfahren ist konventionellen Techniken deutlich überlegen, da zum einen auf Referenzsubstanzen verzichtet werden kann und zum anderen eine hohe Kosteneffizienz durch die benötigten geringen Substanzmengen erreicht wird. Weiterhin wird in diesem Kapitel eine modifizierte Resonatorgeometerie vorgestellt, die Fluoreszenz-untersuchungen in flüssiger Phase zulässt. Der Einfluss von Rotationsdiffusion auf die Mikroresonator-kontrollierte Emission wird diskutiert und sowohl experimentell als auch durch Simulationsrechnungen gezeigt. Aufgrund der äußerst geringen erforderlichen Probenmengen bei gleichzeitig höchster Detektionssensitivität in Verbindung mit der Möglichkeit der Messung im Durchfluss wird das System als mögliches analytisches Detektionswerkzeug in integrierten optischen Systemen vorgeschlagen. Table of Contents Table of Contents VII List of Abbreviations IX 1. Introduction 1 1.1. Scope of this thesis 1 1.2. Outline of this thesis 4 2. Theoretical background and instrumentation 7 2.1. Principles of molecular emission 7 2.2. Experimental methods and instrumentation 20 2.3. Preparation of dye-matrices for bulk and single molecule studies 29 2.4. Autofluorescent proteins 30 3. Multiparameter spectroscopy on single DsRed proteins 37 3.1. Introduction 38 3.2. Experimental methods 39 3.3. Spectral and time domain microscopy 40 3.4. Calculations 46 3.5. Conclusion 52 4. Fluorescence spectroscopy and surface enhanced resonance Raman scattering (SERRS) on the same individual protein and its photoproducts 53 4.1. Introduction 54 4.2. Experimental 56 4.3. Spectroscopic results 59 4.4. Conclusion 68 5. Spectral control of Förster resonant energy transfer (FRET) by the optical mode of a sub-wavelength microresonator 69 5.1. Introduction 70 5.2. Microresonator design 71 5.3. Transmission properties of the microresonator 73 5.4. Spatial resolution of chromophoric subpopulations within DsRed tetramers 74 5.5. Microresonator controlled energy transfer of randomly dispersed donor-acceptor pairs 77 5.6. Single molecule spectroscopy of DsRed in a microresonator 80 5.7. Conclusion 83 6. Controlled disentanglement of coupled dipole emitters by confinement of the electromagnetic field 85 6.1. Introduction 86 6.2. Microresonator design and characterisation 87 6.3. Frequency-domain donor dequenching using continuous-wave irradiation 88 6.4. Time-domain donor dequenching by pump-probe measurements 96 6.5. Conclusion 102 7. Determination of the fluorescence quantum efficiency by mode confinement of the electromagnetic field 103 7.1. Introduction 104 7.2. Experimental 105 7.3. Modeling the fluorescence lifetime of molecules embedded in a microresonator 105 7.4. Towards application: liquid-phase microresonators 107 7.5. Conclusion 114 8. References 115 9. Appendix 127 9.1. Acknowledgement 127 9.2. Summary 130 9.3. Zusammenfassung 132 9.4. Curriculum Vitae 134 9.5. Scientific Contributions 135 9.6. Academic Teachers 138weiterlesen